苏北地区养殖银鲫“鳃出血病”致病病原初步研究

　　摘 要 为了探讨苏北地区人工养殖银鲫（Carassius auratus gibelio）“鳃出血病”的致病病原，取呈现“鳃出血病”典型症状的银鲫鳃组织与肝、脾、肾等内脏器官，制作成组织浆并通过离心分离上清液后均分为4份，分别采用孔径为0.22µm的滤菌膜对上清液过滤除菌、添加双抗杀菌、加热灭菌和不做任何处理等4种方法制备上清液样品，并以健康银鲫组织浆上清液和灭菌生理盐水做对照组。以平均体重为（280.0±13.0）g的银鲫作为试验成鱼组，体重为（87.0±9.0）g的银鲫作为试验幼鱼组。经胸鳍基部对每尾成鱼注射0.3mL，对每尾幼鱼注射0.2mL的上清液后，放回水族箱中继续饲养观察14d，比较了各试验组银鲫的发病状况和死亡率。结果表明，对健康银鲫注射过滤除菌、药物杀菌、加热灭菌以及未做处理的患病银鲫组织浆上清液后，4个试验组成鱼的成活率分别为20.0%、0、80.0%和0，而注射正常银鲫组织浆上清液的成活率为90.0%，注射灭菌生理盐水的试验成鱼的成活率为100.0%。接种过滤除菌、药物杀菌、加热灭菌以及未做处理的组织浆上清液后，4个试验组幼鱼的成活率则分别为50.0%、30.0%、90.0%和30.0%，而注射正常银鲫组织浆上清液和灭菌生理盐水的试验幼鱼的成活率均为100.0%。利用人工感染后发病银鲫组织浆制备的上清液样品，再次接种银鲫的成鱼和幼鱼，结果是注射过滤除菌、药物杀菌、加热灭菌以及未做处理的组织浆上清液后，4个试验组试验成鱼的成活率分别为10.0%、10.0%、0和80.0%，而注射正常银鲫组织浆上清液的成活率为80.0%，注射灭菌生理盐水的试验成鱼成活率为100.0%。接种过滤除菌、药物杀菌、加热灭菌以及未做处理的患病银鲫组织浆上清液后，4个试验组试验幼鱼的成活率则分别为40.0%、20.0%、50.0%和20.0%，而注射正常银鲫组织浆上清液的银鲫幼鱼成活率为90.0%，注射灭菌生理盐水的试验银鲫幼鱼成活率为100.0%。这种结果预示着苏北地区人工养殖银鲫“鳃出血病”的致病病原可能是某种致病病毒。
　　
　　关键词 银鲫；鳃出血病；病原
　　
　　近年来，江苏省盐城地区和大丰等地人工养殖银鲫（Carassius auratus gibelio），从2009年5月开始，陆续出现以鳃出血为典型病症（图1）的暴发性疾病，导致人工养殖银鲫的大面积暴发性死亡，已经对当地的银鲫养殖业者造成了重大经济损失。

　　
　　图1 患“鳃出血病”的银鲫
　　
　　由于我国过去对银鲫病害防治研究基础比较差，对引起暴发性疾病的原因尚不清楚。广大养殖业者面对突然暴发的银鲫疾病缺乏适宜的防治对策，一些针对水产养殖动物疾病的常规防治措施，如采用生石灰和氯制剂消毒及内服抗生素等，均难以有效控制银鲫“鳃出血病”的蔓延。
　　
　　探明银鲫暴发性鳃出血病的病原，是做到对症施治、有效地控制该病的前提。本研究从发病养殖池塘收集具有典型病症的银鲫，将患鳃出血病银鲫鳃组织与内脏组织取出来，匀浆后离心并收集其上清液。通过利用不同的方法处理上清液后制备成带有不同种类病原的组织浆上清液，将其作为感染源注射接种健康银鲫后，根据供试银鲫发生疾病和死亡的状况，推测出人工养殖银鲫“鳃出血病”的病原可能是某种病毒。现将试验结果报道如下。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 试验健康银鲫来源及试验设计
　　
　　从江苏省盐城地区射阳黄沙港养殖区采集的身体无损伤、色泽正常、健康活泼的银鲫作为本研究试验鱼。依据银鲫体重将试验鱼分为2个不同的规格，即将体重为（280.0±13.0）g的银鲫作为试验成鱼组，体重为（87.0±9.0）g的银鲫作为试验幼鱼组。将供试银鲫分别饲养于塑料水族箱中，预备饲养7 d后，从各组银鲫中选择无任何不良症状的银鲫作为本次试验用鱼。每个规格的试验鱼设5个组。在每个盛有1.5 M3的塑料水族箱中放养10尾银鲫。在预备饲养期间，在各水族箱中控制水温变化在22~26℃之间，用充气泵24 h 连续充气，早、晚各投喂盐城裕达饲料有限公司生产的鲫全价饲料各1次。
　　
　　1.2 患病银鲫来源与感染源制备
　　
　　具有暴发性疾病典型症状的患病银鲫从盐城地区射阳县黄沙港水产养殖区某养殖池塘中获得。将患病银鲫解剖后取出鳃组织和肝、脾、肾脏等内部器官，利用电动搅肉机将这些鳃组织和内部器官进行组织匀浆后离心并收集上清液，将收集的上清液均分为4份盛装在三角烧瓶中。将第1份上清液在滤菌器中经孔径为0.22µm的滤菌膜过滤，除去其中细菌后作为滤菌上清液样品；在第2份上清液中加入青霉素和链霉素（Difco），使这2种抗生素在上清液中的浓度分别达到100.0µg/g，杀菌处理30 min后作为杀菌上清液样品；将盛装第3份上清液的三角烧瓶置于100℃水浴锅中，保持1 h以杀灭其中的细菌和病毒后，作为加热杀菌上清液样品。用移液器分别在第1份、第2份和第3份上清液样品中，分别取100.0µL上清液接种在BHIA（Difco）平皿中，在25℃培养箱中培养48 h，证实3种上清液样品中没有存活细菌后，作为不同处理的试验组注射上清液样品，如果有菌落出现则将该样品弃之不用。对第4份组织浆液不作任何处理，作为有细菌和病毒试验组注射上清液样品。另外，选择10尾无任何症状50.0g左右的银鲫，依上述方法制备组织浆和上清液，不做任何处理即作为第5份未经处理的正常组织浆液上清液。制作好的上清液样品均保存在4℃冰箱中，备用。
　　
　　1.3 注射上清液接种
　　
　　采用经过胸鳍基部注射的方法接种上述各种组织浆上清液，对试验成鱼组每尾供试鱼注射0.3mL，而对试验幼鱼组每尾供试鱼注射0.2mL。将注射滤菌上清液样品的供试鱼作为试验1组；注射药物杀菌上清样品作为试验2组；注射热灭活上清样品的供试鱼作为试验3组，注射未经处理的患病鱼组织上清液样品的试验鱼作为第4组，注射未经处理的正常鱼组织上清液样品的试验鱼作为第5组，将注射0.7%的灭菌生理盐水的试验鱼作为对照组。注射结束后仍然放回水族箱中继续饲养。
　　
　　1.4 用感染后患病银鲫制备组织浆上清液后人工再接种
　　
　　从人工注射患病银鲫组织浆上清液后，发生“鳃出血病”典型症状的银鲫中选取数尾鱼，按照1.2项中所述方法制备患病与正常鱼组织浆上清液后，按照1.3所述方法再次注射接种供试银鲫。以观察供试银鲫的疾病发生与死亡状况。
　　
　　1.5 饲养观察
　　
　　对经过注射接种后各规格的试验组银鲫按照体重的2.0%投喂饲料，每天早晚各1次。自注射结束后开始计算，连续饲养观察14 d，记录供试银鲫疾病发生状态以及死亡发生的时间。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 注射病鱼组织上清液后银鲫发病与死亡状况
　　
　　采用不同方式处理后的病鱼组织上清液注射不同规格银鲫后，供试银鲫疾病发生状态和死亡时间状况见表1。从表1可以看出，经过接种经不同方法处理的患病与正常银鲫组织浆上清液后，成鱼发病和死亡率均比幼鱼高。接种过滤除菌组试验成鱼在14d的观察期内，仅有20.0%的存活率，药物处理组试验成鱼100.0%死亡，加热处理组试验成鱼只有80.0%存活率，未做处理对照组试验成鱼全部死亡，注射正常组织上清液的试验成鱼有90.0%存活，而注射灭菌生理盐水的对照成鱼100.0%存活。
　　
　　表1 注射各种处理的患病银鲫组织浆上清液后不同规格银鲫成活率

　　
　　试验鱼 处理方法 供试鱼数（尾） 存活鱼数（尾） 成活率（%）
　　
　　成鱼 过滤除菌 10 2 20.0
　　
　　药物除菌 10 0 0
　　
　　加热除菌 10 8 80.0
　　
　　未做处理对照 10 0 0
　　
　　正常组织 10 90 90.0
　　
　　生理盐水 10 10 100.0
　　
　　幼鱼 过滤除菌 10 5 50.0
　　
　　药物除菌 10 3 30.0
　　
　　加热除菌 10 9 90.0
　　
　　未做处理对照 10 3 30.0
　　
　　正常组织 10 10 100.0
　　
　　生理盐水 10 10 100.0
　　
　　在相同的饲养方式和条件下，供试银鲫幼鱼死亡率则比较低。经过接种不同方法处理的患病与正常银鲫组织浆上清液后，接种过滤除菌试验幼鱼在14d的观察期内，供试鱼有50.0%存活，药物处理组试验幼鱼组30.0%存活；加热处理组试验幼鱼有90.0%存活，未做处理对照组试验幼鱼30.0%存活，注射正常组织上清液的试验幼鱼100.0%存活，而注射灭菌生理盐水的对照幼鱼也是100.0%存活。
　　
　　2.2 注射人工致病银鲫组织上清液后银鲫发病与死亡状况
　　
　　从人工致病银鲫中收集鳃组织和肝、脾、肾脏组织，采用不同方式处理后制备成病鱼组织上清液注射不同规格银鲫后，供试银鲫疾病发生状态和死亡时间状况见表2。从表2可以看出，接种过滤除菌试验成鱼在14d的观察期内，供试成鱼有10.0%存活；药物处理组试验成鱼组10.0%存活；加热处理组试验成鱼有100.0%存活；未做处理对照组试验成鱼没有鱼存活；注射正常组织上清液的试验成鱼80.0%存活；而注射灭菌生理盐水的对照成鱼100.0%存活。
　　
　　表2 注射各种处理的人工致病银鲫组织浆上清液后不同规格银鲫成活率

　　
　　试验鱼 处理方法 供试鱼数（尾） 存活鱼数（尾） 成活率（%）
　　
　　成鱼 过滤除菌 10 1 10.0
　　
　　药物除菌 10 1 10.0
　　
　　加热除菌 10 10 100.0
　　
　　未做处理对照 10 0 0
　　
　　正常组织 10 80 80.0
　　
　　生理盐水 10 10 100.0
　　
　　幼鱼 过滤除菌 10 4 40.0
　　
　　药物除菌 10 2 20.0
　　
　　加热除菌 10 5 50.0
　　
　　未做处理对照 10 2 20.0
　　
　　正常组织 10 9 90.0
　　
　　生理盐水 10 10 100.0
　　
　　在相同的饲养方式和条件下，供试银鲫的幼鱼死亡率比较低。接种过滤除菌试验成鱼在14d的观察期内，供试幼鱼有40.0%存活；药物处理组试验成鱼组20.0%存活；加热处理组试验幼鱼有50.0%存活，未做处理对照组试验幼鱼20.0%存活；注射正常组织上清液的试验成鱼90.0%存活，而注射灭菌生理盐水的对照成鱼100.0%存活。
　　
　　3 讨论
　　
　　在养殖现场对苏北地区人工养殖银鲫出现大批死亡的鱼体，进行解剖学检查时，可以观察到2种比较明显的症状。有一种症状是鳃丝肿胀，养殖业者将具有这种症状的病鱼称作“大红鳃”（图2）。这种所谓的“大红鳃”病，是从2008年上半年开始在苏北地区零

　　
　　图2 患“大红鳃”的银鲫
　　
　　星出现，发病时间从5月初开始，濒死鱼“黑头”较多。除感染危害银鲫外，还可感染草鱼及团头鲂。患“大红鳃”病鱼的鳃丝呈现鲜红色，当患病鱼体离水数分钟后鳃丝即转为暗红色，一般有出现“花鳃”的现象，镜检通常发现鳃上有指环虫，解剖发现内部器官出现不同程度的糜烂，有比较多的淡黄色透明腹水。患病池塘大多用过刺激性较强的杀虫药物，发生“大红鳃”病后银鲫的死亡量较大，但是，通过采用微生态制剂等改善水质环境、二氧化氯等消毒剂进行水体消毒，同时选择对致病菌敏感的抗生素类药物投喂，可以有效地缓解这种疾病的蔓延速度。
　　
　　另一种症状主要是呈现“鳃出血”的症状，这种疾病自2009年开始最先在射阳周边的养殖场出现。发病时间从4月初即开始，主要感染100.0g以上的银鲫，表现为鳃部严重充血，严重时出现鳃部向外喷血的现象（图3），将具有典型症状的濒死鱼提离水面时，鳃部

　　
　　图3 接种患病银鲫组织浆上清液后，患病鱼鳃部喷血导致水族箱中水色变红
　　
　　（左下方水族箱）
　　
　　即开始大量出血，血液会顺着鳃丝流出，在下颌等体表处分布点状出血点，解剖见肝脏出血，脾脏、肾脏肿大，严重时鱼鳔分布大量出血点。对于出现“鳃出血病”症状的池塘，通过采用微生态制剂等改善水质环境、二氧化氯等消毒剂进行水体消毒，同时选择对致病菌敏感的抗生素类药物投喂，不能有效地缓解这种疾病的蔓延速度。因此，目前对于这种疾病尚无有效控制措施。
　　
　　在本研究中，我们采用对患病银鲫组织上清液进行滤菌膜过滤除菌、添加双抗药物处理杀菌、加热处理杀菌以及不做任何处理等方法制备病鱼组织浆上清液样品，与注射正常组织上清液和灭菌生理盐水的试验于比较，初步阐明了养殖银鲫“鳃出血病”的病原可能是某种病毒。这是因为将患病银鲫组织上清液进行滤菌膜过滤和添加双抗药物处理，均可以达到除去或者杀灭组织浆上清液中细菌而保留病毒的目的，而对健康银鲫接种这些组织上清液后能导致试验与出现“鳃出血”的典型症状。通过接种经过加热处理和正常组织上清液的试验鱼存活率均比较高，可能预示着组织浆上清液中的银鲫组织，对供试健康银鲫不会导致出现疾病症状。而注射灭菌生理盐水的对照鱼均未出现异常状况，说明饲养条件和注射操作对试验鱼造成的应激性刺激不至于导致供试鱼发生“鳃出血病”。
　　
　　我们这个研究结果虽然未能证明养殖银鲫“鳃出血病”究竟是由什么种类的病毒引起的，但是，已经初步提示这种病的病原有可能是某种病毒，从而为这种疾病的预防和治疗提示了方向。